La función de YY2 en células troncales y durante el desarrollo preimplantacional.
Yin Yang2 (Yy2) es un factor de transcripción que se originó a partir de Yin Yang1 (Yy1) por retroposición. Comparte gran homología con YY1 en los dominios de “Dedos de Zinc” igual que Reduced expression-1 (Rex1/Zfp42) y tanto Yy2 como Rex1 están presentes únicamente en mamíferos placentarios (Kim et al, 2007). Durante el desarrollo embrionario preimplantacional se suceden numerosos procesos únicos que requieren de efectores y mecanismos específicos de este periodo. Entre ellos la metilación del DNA es intensamente reprogramada, con la consecuencia de periodos de mínimo control a través de este mecanismo (Mayer et al, 2000a; Oswald et al, 2000; Rougier et al, 1998). Coincidente con estos periodos, se detecta una elevada expresión de elementos retrovirales endógenos (ERVs), en particular en la línea germinal, en embriones de preimplantación y en la placenta (Spencer & Palmarini, 2012; Taruscio & Mantovani, 2004). Los ERVs son secuencias que provienen de elementos transponibles (Waterston et al, 2002), y pueden modular la expresión de genes cercanos o a cierta distancia del locus (Schoorlemmer et al, 2014). Tanto YY1 como REX1 se han asociado a la regulación y al silenciamiento de ERVs (Guallar et al, 2012; Schlesinger et al, 2013). La implicación de los factores de transcripción YY1 y REX1 en otras funciones exclusivas de mamíferos placentarios como la inactivación del cromosoma X (Kim et al, 2003; Navarro et al, 2010), y la asociación selectiva de YY1 a locus genómicos cuya expresión depende de improntas paternales en mamíferos (Kim et al, 2003) ha sido descrita previamente.
Valorando el marco funcional de la familia YY y la exclusiva presencia de Yy2 en mamíferos placentarios, nos planteamos la hipótesis de la implicación de YY2 en mecanismos reguladores únicos de la línea germinal y en funciones específicas del desarrollo pre y peri-implantacional. Dada la ausencia de datos sobre la expresión y función de la proteína YY2 en estadios y procesos relacionados con la implantación o previos a ella, el objetivo de este estudio ha sido caracterizar la expresión de YY2 y determinar su función en la línea germinal, el desarrollo embrionario preimplantacional y la placentación en el ratón. Se ha estudiado la función de YY2 en líneas troncales espermatogoniales, en embriones preimplantacionales, en células troncales embrionarias, en células troncales del trofoectodermo y en la placenta.
En primer lugar hemos estudiado la implicación de YY2 en la línea germinal masculina de ratón. En particular, hemos analizado la expresión de YY2 en las células espermatogoniales troncales de ratón e identificado genes a los que se une potencialmente YY2 en estas células troncales. Dentro del testículo hemos observado que YY2 se expresa en células con morfología y localización propia de gonocitos en testículos postnatales de 3.5 días post-coitum (dpc). En testículos de ratones peri-puberales y adultos, hemos detectado la expresión de YY2 dentro de los túbulos seminiferos, particularmente en células localizadas en la capa más externa. La localización y morfología de las células positivas para YY2 en testículos de 3 semanas de edad o más que hemos observado, es compatible con la expresión de YY2 en células espermatogoniales indiferenciadas. Así, hemos estudiado YY2 en células troncales espermatogoniales (mSSCs) de ratón en cultivo. Hemos detectado la expresión de Yy2 a nivel de RNA y de proteína en células mSSCs in vitro. Con motivo de valorar si YY2 se asocia específicamente a ERVs en mSSCs hemos realizado ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Hemos detectado que YY2 se une específicamente a ERVs de diferentes clases (clase II (IAP, musD), clase III (muERV-L, MALR) en mSSCs. Entre ellos, hemos observado que YY2 se asocia con mayor afinidad a IAP (observado como enriquecimiento en ensayos ChIP). Se han identificado loci a los que se asocia YY2 mediante secuenciación de la cromatina inmunoprecipitada por YY2. Los loci más prometedores han sido validados mediante ChIP-qPCR, identificando así potenciales dianas de YY2 en mSSCs.
Posteriormente, hemos caracterizado la expresión de YY2 durante el desarrollo preimplantacional del ratón, así como en líneas celulares representativas del estadio de blastocisto. Hemos detectado la expresión de Yy2 a nivel de RNA y de proteína a lo largo de todos los estadios embrionarios de preimplantación, en células embrionarias troncales (ES) como modelo in vitro de la masa celular interna del embrión (ICM) y en células troncales del trofoectodermo (TS) como modelo in vitro del trofoectodermo (TE). Hemos observado que el patrón de expresión de YY2 durante el desarrollo preimplantacional es dinámico tanto a nivel de expresión como en su localización intracelular. Hemos observado la entrada de la proteína YY2 en el núcleo en embriones de dos células, y un pico de expresión en el estadio de morula. En el blastocisto, YY2 presenta un patrón de expresión peri-nuclear en la ICM, mientras que la expresión es nuclear y más prominente en el TE.
Quisimos evaluar la implicación de Yy2 en la capacidad de autorrenovación in vitro de las células ES. Para ello hemos generado un modelo de células ES con niveles atenuados de YY2 y realizado ensayos de formación de colonias. Hemos observado que las células ES con niveles atenuados de YY2 forman menor número de colonias con morfología pluripotente en comparación con colonias formadas con células ES silvestres. A nivel molecular no hemos detectado modificaciones en la expresión de marcadores del circuito central de pluripotencia. Hemos detectado una desregulación menor de la expresión de algunos ERVs. Sorprendentemente, hemos observado que bajos niveles de YY2 en colonias de células ES provocan la desregulación de Zscan4. Zscan4 es un gen importante para la estabilidad genómica de las células ES (Zalzman et al, 2010). Zscan4 se expresa en embriones en el estadio de dos células y en una subpoblación de células ES en cultivo que presentan características propias del estadio embrionario de dos células tales como la totipotencia (Falco et al, 2007; Macfarlan et al, 2012).
Además, hemos analizado la función de Yy2 durante el desarrollo preimplantacional de ratón. Con este objetivo, hemos realizado ensayos de pérdida de función con siRNAs contra Yy2. Posteriormente, hemos evaluado los embriones con niveles atenuados de Yy2 mediante la valoración del desarrollo in vitro de los embriones hasta el estadio de blastocisto y los niveles de expresión de dianas potenciales de YY2. Hemos observado que la pérdida de Yy2 no afecta al desarrollo in vitro de los embriones hasta el estadio de blastocisto. A nivel molecular, hemos detectado que la atenuación de la expresión de Yy2 no provoca la desregulación de ERVs.
YY2 se asocia a ERVs en células TS, siendo IAP la diana a la que se une con más eficacia (Guallar et al, 2012). Hemos realizado ensayos ChIP y posteriormente secuenciado la cromatina inmunoprecipitada específicamente por YY2. Se ha realizado un análisis del reparto de las secuencias obtenidas a lo largo del genoma mediante la aplicación de herramientas informáticas. La agrupación de secuencias (“picos”) en la muestra experimental y no en la muestra control nos ha permitido identificar loci asociados a YY2 en células TS. Las secuencias con mayor enriquecimiento han sido validadas mediante ChIP-qPCR determinando dianas bona fide de YY2 en células TS. Las dianas más prometedoras comparten una secuencia GAAGTGG que podrá representar un consenso al que se une YY2 in vivo en células TS. Comparando la asociación de YY2 y YY1 a las mismas secuencias hemos demostrado que YY2 no se asocia a dianas de YY1 y viceversa, confirmando la especificidad de nuestro ensayo.
Finalmente, hemos caracterizado la expresión de YY2 en la placenta de ratón. Hemos detectado la expresión de Yy2 a nivel de RNA en tejidos extraembrionarios de ratones de 11.5 dpc. Aunque hemos detectado la expresión de Yy2 en tejido de los sacos visceral y parietal de la placenta, la expresión de Yy2 es predominante en disco placentario. Hemos detectado YY2 en tejido placentario de ratones de 11.5 días y 18.5 días mediante inmunohistoquímica. Su patrón de localización sugiere que YY2 se expresa en las células gigantes del trofoblasto (TGCs) que se encuentran en la zona marginal del disco placentario y en subtipos de TGCs asociados a los vasos sanguíneos maternos y alrededor de las lagunas vasculares. En ensayos previos se identificaron genes cercanos a loci asociados a REX1 mediante secuenciación masiva de la cromatina (Guallar et al, in preparation). Se ha analizado la expresión a nivel de RNA de esos marcadores en tejido placentario de un modelo de ratón deficiente en Rex1. Hemos detectado niveles de expresión aumentados Jdp2, Chd2 y PisD en tejido placentario de ratones mutantes para Rex1 en comparación con tejido placentario de ratones silvestres. El gen más desregulado ha sido PisD, un factor fundamental en la placenta (Steenbergen et al, 2005).
Los resultados de este trabajo apoyan la hipótesis de que YY2 es importante en el desarrollo pre y peri-implantacional del ratón. Proponemos la implicación de YY2 en procesos fundamentales de mamíferos placentarios tales como la gametogénesis masculina, la identidad de las células ES, la especificación de linaje en el desarrollo preimplantacional y el desarrollo de la placenta. Hemos identificado sitios de unión in vivo, los genes colindantes a ellos, y a unas dianas directas de YY2. Sin descartar otros mecanismos de acción de YY2, proponemos que dicha implicación ocurre a través de la regulación que ejerce YY2 sobre estas dianas.
Yin Yang2 (Yy2) es un factor de transcripción que se originó a partir de Yin Yang1 (Yy1) por retroposición. Comparte gran homología con YY1 en los dominios de “Dedos de Zinc” igual que Reduced expression-1 (Rex1/Zfp42) y tanto Yy2 como Rex1 están presentes únicamente en mamíferos placentarios (Kim et al, 2007). Durante el desarrollo embrionario preimplantacional se suceden numerosos procesos únicos que requieren de efectores y mecanismos específicos de este periodo. Entre ellos la metilación del DNA es intensamente reprogramada, con la consecuencia de periodos de mínimo control a través de este mecanismo (Mayer et al, 2000a; Oswald et al, 2000; Rougier et al, 1998). Coincidente con estos periodos, se detecta una elevada expresión de elementos retrovirales endógenos (ERVs), en particular en la línea germinal, en embriones de preimplantación y en la placenta (Spencer & Palmarini, 2012; Taruscio & Mantovani, 2004). Los ERVs son secuencias que provienen de elementos transponibles (Waterston et al, 2002), y pueden modular la expresión de genes cercanos o a cierta distancia del locus (Schoorlemmer et al, 2014). Tanto YY1 como REX1 se han asociado a la regulación y al silenciamiento de ERVs (Guallar et al, 2012; Schlesinger et al, 2013). La implicación de los factores de transcripción YY1 y REX1 en otras funciones exclusivas de mamíferos placentarios como la inactivación del cromosoma X (Kim et al, 2003; Navarro et al, 2010), y la asociación selectiva de YY1 a locus genómicos cuya expresión depende de improntas paternales en mamíferos (Kim et al, 2003) ha sido descrita previamente.
Valorando el marco funcional de la familia YY y la exclusiva presencia de Yy2 en mamíferos placentarios, nos planteamos la hipótesis de la implicación de YY2 en mecanismos reguladores únicos de la línea germinal y en funciones específicas del desarrollo pre y peri-implantacional. Dada la ausencia de datos sobre la expresión y función de la proteína YY2 en estadios y procesos relacionados con la implantación o previos a ella, el objetivo de este estudio ha sido caracterizar la expresión de YY2 y determinar su función en la línea germinal, el desarrollo embrionario preimplantacional y la placentación en el ratón. Se ha estudiado la función de YY2 en líneas troncales espermatogoniales, en embriones preimplantacionales, en células troncales embrionarias, en células troncales del trofoectodermo y en la placenta.
En primer lugar hemos estudiado la implicación de YY2 en la línea germinal masculina de ratón. En particular, hemos analizado la expresión de YY2 en las células espermatogoniales troncales de ratón e identificado genes a los que se une potencialmente YY2 en estas células troncales. Dentro del testículo hemos observado que YY2 se expresa en células con morfología y localización propia de gonocitos en testículos postnatales de 3.5 días post-coitum (dpc). En testículos de ratones peri-puberales y adultos, hemos detectado la expresión de YY2 dentro de los túbulos seminiferos, particularmente en células localizadas en la capa más externa. La localización y morfología de las células positivas para YY2 en testículos de 3 semanas de edad o más que hemos observado, es compatible con la expresión de YY2 en células espermatogoniales indiferenciadas. Así, hemos estudiado YY2 en células troncales espermatogoniales (mSSCs) de ratón en cultivo. Hemos detectado la expresión de Yy2 a nivel de RNA y de proteína en células mSSCs in vitro. Con motivo de valorar si YY2 se asocia específicamente a ERVs en mSSCs hemos realizado ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Hemos detectado que YY2 se une específicamente a ERVs de diferentes clases (clase II (IAP, musD), clase III (muERV-L, MALR) en mSSCs. Entre ellos, hemos observado que YY2 se asocia con mayor afinidad a IAP (observado como enriquecimiento en ensayos ChIP). Se han identificado loci a los que se asocia YY2 mediante secuenciación de la cromatina inmunoprecipitada por YY2. Los loci más prometedores han sido validados mediante ChIP-qPCR, identificando así potenciales dianas de YY2 en mSSCs.
Posteriormente, hemos caracterizado la expresión de YY2 durante el desarrollo preimplantacional del ratón, así como en líneas celulares representativas del estadio de blastocisto. Hemos detectado la expresión de Yy2 a nivel de RNA y de proteína a lo largo de todos los estadios embrionarios de preimplantación, en células embrionarias troncales (ES) como modelo in vitro de la masa celular interna del embrión (ICM) y en células troncales del trofoectodermo (TS) como modelo in vitro del trofoectodermo (TE). Hemos observado que el patrón de expresión de YY2 durante el desarrollo preimplantacional es dinámico tanto a nivel de expresión como en su localización intracelular. Hemos observado la entrada de la proteína YY2 en el núcleo en embriones de dos células, y un pico de expresión en el estadio de morula. En el blastocisto, YY2 presenta un patrón de expresión peri-nuclear en la ICM, mientras que la expresión es nuclear y más prominente en el TE.
Quisimos evaluar la implicación de Yy2 en la capacidad de autorrenovación in vitro de las células ES. Para ello hemos generado un modelo de células ES con niveles atenuados de YY2 y realizado ensayos de formación de colonias. Hemos observado que las células ES con niveles atenuados de YY2 forman menor número de colonias con morfología pluripotente en comparación con colonias formadas con células ES silvestres. A nivel molecular no hemos detectado modificaciones en la expresión de marcadores del circuito central de pluripotencia. Hemos detectado una desregulación menor de la expresión de algunos ERVs. Sorprendentemente, hemos observado que bajos niveles de YY2 en colonias de células ES provocan la desregulación de Zscan4. Zscan4 es un gen importante para la estabilidad genómica de las células ES (Zalzman et al, 2010). Zscan4 se expresa en embriones en el estadio de dos células y en una subpoblación de células ES en cultivo que presentan características propias del estadio embrionario de dos células tales como la totipotencia (Falco et al, 2007; Macfarlan et al, 2012).
Además, hemos analizado la función de Yy2 durante el desarrollo preimplantacional de ratón. Con este objetivo, hemos realizado ensayos de pérdida de función con siRNAs contra Yy2. Posteriormente, hemos evaluado los embriones con niveles atenuados de Yy2 mediante la valoración del desarrollo in vitro de los embriones hasta el estadio de blastocisto y los niveles de expresión de dianas potenciales de YY2. Hemos observado que la pérdida de Yy2 no afecta al desarrollo in vitro de los embriones hasta el estadio de blastocisto. A nivel molecular, hemos detectado que la atenuación de la expresión de Yy2 no provoca la desregulación de ERVs.
YY2 se asocia a ERVs en células TS, siendo IAP la diana a la que se une con más eficacia (Guallar et al, 2012). Hemos realizado ensayos ChIP y posteriormente secuenciado la cromatina inmunoprecipitada específicamente por YY2. Se ha realizado un análisis del reparto de las secuencias obtenidas a lo largo del genoma mediante la aplicación de herramientas informáticas. La agrupación de secuencias (“picos”) en la muestra experimental y no en la muestra control nos ha permitido identificar loci asociados a YY2 en células TS. Las secuencias con mayor enriquecimiento han sido validadas mediante ChIP-qPCR determinando dianas bona fide de YY2 en células TS. Las dianas más prometedoras comparten una secuencia GAAGTGG que podrá representar un consenso al que se une YY2 in vivo en células TS. Comparando la asociación de YY2 y YY1 a las mismas secuencias hemos demostrado que YY2 no se asocia a dianas de YY1 y viceversa, confirmando la especificidad de nuestro ensayo.
Finalmente, hemos caracterizado la expresión de YY2 en la placenta de ratón. Hemos detectado la expresión de Yy2 a nivel de RNA en tejidos extraembrionarios de ratones de 11.5 dpc. Aunque hemos detectado la expresión de Yy2 en tejido de los sacos visceral y parietal de la placenta, la expresión de Yy2 es predominante en disco placentario. Hemos detectado YY2 en tejido placentario de ratones de 11.5 días y 18.5 días mediante inmunohistoquímica. Su patrón de localización sugiere que YY2 se expresa en las células gigantes del trofoblasto (TGCs) que se encuentran en la zona marginal del disco placentario y en subtipos de TGCs asociados a los vasos sanguíneos maternos y alrededor de las lagunas vasculares. En ensayos previos se identificaron genes cercanos a loci asociados a REX1 mediante secuenciación masiva de la cromatina (Guallar et al, in preparation). Se ha analizado la expresión a nivel de RNA de esos marcadores en tejido placentario de un modelo de ratón deficiente en Rex1. Hemos detectado niveles de expresión aumentados Jdp2, Chd2 y PisD en tejido placentario de ratones mutantes para Rex1 en comparación con tejido placentario de ratones silvestres. El gen más desregulado ha sido PisD, un factor fundamental en la placenta (Steenbergen et al, 2005).
Los resultados de este trabajo apoyan la hipótesis de que YY2 es importante en el desarrollo pre y peri-implantacional del ratón. Proponemos la implicación de YY2 en procesos fundamentales de mamíferos placentarios tales como la gametogénesis masculina, la identidad de las células ES, la especificación de linaje en el desarrollo preimplantacional y el desarrollo de la placenta. Hemos identificado sitios de unión in vivo, los genes colindantes a ellos, y a unas dianas directas de YY2. Sin descartar otros mecanismos de acción de YY2, proponemos que dicha implicación ocurre a través de la regulación que ejerce YY2 sobre estas dianas.